효소반응 속도론 예비보고서

1. 실험목적

 

본 실험의 목적은 효소 반응속도론에 대해 이해하고 다양한 효소들 중에서 트립신(trypsin)을 사용하여 반응속도에 영향을 미치는 변수들에 대하여 알아보는 것이다. 트립신은 단백질 분해효소로서 단백질을 펩타이드와 아미노산으로 가수분해하는 효소이다. 효소의 일차적 기능은 유기체의 요구에 알맞게 반응속도를 가속시키는 것이며 이는 Michaels-Menten 방정식을 통해 효소 촉매활성과 촉매효율을 통하여 표현된다.

 

2. 서론(이론적 배경)

 

1) 트립신(trypsin)

 

트립신은 단백질 분해효소로서 단백질을 더 작은 단위인 펩타이드(peptide)나 아미노산으로 가수분해하는 췌장유래의 효소이다. 단백질의 소화에 있어서 펩신과 함께 중요한 역할을 한다. 즉, 위에서 펩신에 의해 가수분해를 받아 생긴 펩타이드는 소장에서 키모트립신과 트립신에 의해 가수분해 되어 더 작은 펩타이드가 된다. 그 후 카복시펩티다아제(carboxypeptidase), 다이펩티다아제(dipeptidase), 아미노-펩티다아제(amino peptidase) 등의 효소들로부터 가수분해 된 최종 산물인 아미노산 혼합물이 되어 흡수된다.

 

2) 티립신의 구조와 기능

단백질 분해 효소의 기질 특이성은 가수분해를 받는 펩타이드 결합의 N말단 아미노산 잔기(P1 잔기)를 인식하는 S1 포켓(catalytic pocket)의 구조로부터 주로 결정된다. 트립신의 S1 포켓에 위치하는 aspartate residue(ASP189)가 양(positive) 전하된 라이신(lysine)이나 아르기닌(arginine)을 끌어당기고 안정화시키는 역할을 하고, 이러한 구조로 인해 효소의 기질특이성을 가지게 된다. 이는 대부분의 트립신이 라이신과 아르기닌 뒤에 프롤린(proline)이 위치한 경우를 제외하고, 아미노산들의 카르복실말단(C-terminal side)에서 단백질을 자르는 것을 의미한다.

트립신은 펩타이드 결합(peptide bond)의 가수분해를 촉진시키는 기능을 한다. 다른 세린(serine) 형태의 단백질 분해효소들의 반응 메커니즘과(reaction mechanism)과 동일하게 세작용기 촉매(catalytic triad)가 세린의 활성부위(active site)를 친핵성(nucleo-philic)을 띄도록 만드는데, 이는 세린의 정전기적 환경을 조작하는 것으로 가능하다. 트립신의 효소 촉매반응은 열-동력학적으로 유리하지만 높은 활성화 에너지를 요구한다. 트립신의 최적 pH는 8정도이고, 최적온도는 37℃이다.

 

트립신은 강한 친핵성을 이용하여 반응성이 작은 카르복실기를 공격함으로서 펩타이드 결합들을 분해시킨다. 여기서 사용되는 강한 친핵성은 효소의 활성부위에 위치한 세린 195 잔여물질(serin 195 residue)로 기질과 간단히 공유결합된 효소-기질 복합체(enzyme substrate intermediate) 형태이다. 기질은 -Benzoyl-Arg-p-nitroanilide(BAPNA)로 수용액 상에서 트립신과 반응시키면 기질인 BAPNA가 가수분해되어 benzol-Arg와 p-nitroaniline으로 두 가지 생성물을 만든다. 이 때 p-nitroaniline은 발색단을 가진 화합물로서 노란색을 띄며 분광광도계 410 nm 파장에서 최대 흡광도를 가지며, 이를 측정하여 효소활성을 정량할 수 있다.

 

트립신과 기질사이의 반응은 두 가지 단계로 일어난다. 반응 초기의 버스트(burst) 단계와 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten)의 반응속도론을 따르는 정상상태(steady-state) 단계로 구성된다. 이는 ‘ping-pong' 메커니즘이라고도 부른다. 트립신의 활동 방식은 이 두 단계에서 일어나는 가수분해로 설명된다. 처음에는 아실-효소 복합체(acyl-enzyme intermediate)의 형성을 위해 기질의 아실화(acylation)이 일어나고 효소의 원래 상태로 돌아가기 위한 디아실화(deacylation)가 일어난다.

 

3) 효소 반응 속도론

 

 (P=P1+P2)

(E : Enzyme, S : substrate, P : product)

 

-미카엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 방정식

 

 

기질 농도  [S]의 함수에 따른 반응속도  의 그림으로 미카엘리스-멘텐 반응속도론을 따르는 효소는 최대 속도에 점근적으로 도달된다는 것을 보여준다. 미카엘리스 상수 은 (최대속도의 절반)의 속도에 도달하는 기질농도이다. 효소 반응속도의 이중-역수 도표는 함수에 따른을 도식함으로써 만들어 진다. 기울기는이고, 세로축의 절편은 가로축의 절편은이다.

 

- 과    를 결정하는 방법

 

최근에는 컴퓨터내의 곡선 맞춤(curve fitting) 프로그램을 통하여    과 를 결정할 수 있다. 그러나 이 전에는 미카엘리스-멘텐 방정식을 대수학적 과정을 통해 구하였다. 위 방정식에 역수를 취한 것으로 이 방적식은 라인위버-버크 방정식 (Lineweaver-Burk equation) 또는 이중-역수 도표(double reciprocal plot)라고 불린다.

 

-라인위버-버크 방정식(Lineweaver-Burk equation)

 : 촉매반응이 일어나기 위해 요구되는 기질농도 척도

 : 효소가 기질로 포화되었을 때 단위시간당 생성물로 전환한 기질 분자의 수 

 : 촉매 효율의 척도. 특정 기질에 대한 촉매 반응속도와 세기 고려

 

 

3. Instruments & Materials

 

3.1 Instruments

 

- Micropipettes & tips : 10 μl, 200 μl, 1000 μl

- E-tube(1.5 ml), conical tube (50 ml)

- Vortexer

- Spectrophotometer (Shimadzu UV-1650)

- Cuvette

 

3.2 Reagents

 

- 효소 [E] : Trypsin (TR, Sigma-T0303, CAS 9002-07-7)

- 완충용액 (Buffer) : 100mM Phosphate buffer (pH 7.0)

- 기질 [S] : -Benzoyl-Arg-p-nitroanilide (BP, Sigma-B3133, MW: 434.9)

- 용매 (solvent) : N,N-Dimethylformamide(DMF)(Sigma-227056, anhydeous, 99.8%)

 

4. Experimental procedure

 

반응 온도 - 실내 온도 (room temp.)

반응 조건 - 효소[E]의 농도 1mg/ml in 100mM phosphate buffer (pH 7.0)

기질 [S]의 농도 : 10 ~ 200mM

측정 방법 - 분광광도계(spectrophotometer) 파장 410nm에서 흡광도 측정

혼합 비율 - 완충 용액(buffer) : 기질[S] : 효소[E] = 980 μl : 10 μl : 10 μl

 

- 트립신의 반응속도 측정

 

1. 100mM Phosphate buffer pH 7.0 50ml를 준비하고 실온에 방치한다.

2. 효소 [E]를 1 mg/ml 농도로 준비하고 실온에 방치한다.

3. 기질[S]을 각각의 농도별로 준비한다. 10, 20, 40, 80 ,160, 200mM

참고 - 기질은 DMF 용매에 녹이며 200mM의 기질을 희석시켜 만든다.

4. E-tube에 100mM phosphate buffer 980 μl를 넣고, 10 μl의 기질[S]을 넣 은 후 뚜껑을 닫고 잘 섞어준다.

5. 위의 E-tube 혼합액을 cuvette에 옮긴 후 10μl의 효소를 넣고 시간을 측 정한다.

6. 매 1분마다 410nm 파장에서 분광광도계로 흡광도를 측정한다.(5분간)